Espectrofotometria Ultravioleta / Visível


CONCEITO

A espectrofotometria pode ser denominada, como um método analítico espectrofotométrico de absorção ,na qual as espécies absorventes de uma amostra a serem analisadas,são colocadas num recipiente chamado de cubeta , e ao passar um feixe de radiação monocromática através da dela , uma parte da energia radiante é absorvida e a outra é absorvida pelo meio.Esta energia medida é expressa em % de transmitância ou em absorbância.
A quantitativa é regida pela Lei de Lambert-Beer , na qual estabelece a relação entre a concentração e a quantidade de radiação absorvida por uma espécie química.

A= log(I0/I) = log1/t = log100/%t = ai x ci x d

onde:

A =log Io /I

A =log 1/T

A = 100 /%T
A = ai.ci.d

· A=absorbância ou densidade ótica
· I0=intensidade da radiação incidente
· I=intensidade da radiação transmitida
· ci=concentração do componente i(g/l)
· d=espessura da célula(cm)
· ai=absortividade ou coeficiente de absorção ou coeficiente de extinção do componente i
· I / I0=transmitância(T)


O ESPECTROFOTÔMETRO


APLICAÇÕES DA TÉCNICA

O espectro ultravioleta e visível nos fornece informações limitadas sobre as estruturas químicas de uma substância. Mas, por causa da sensibilidade destas técnicas e do alto grau de precisão e exatidão em suas medidas , elas são empregadas extensivamente em determinações quantitativas.As aplicações da espectrofotometria são para determinação de compostos orgânicos e inorgânicos , resumindo:

1_Análise comparativa de substâncias (problema e padrão)
2_Análise de compostos orgânicos e inorgânicos que apresentam ligações duplas e triplas, ligações conjugadas , cromóforos , complexos inorgânicos com metais de transição.
3_Em compostos orgânicos que apresentam grupos carbonilas, dienos conjugados , aromáticos , etc.

A espectrofotometria UV-VIS se aplica a moléculas orgânicas , íons inorgânicos ou complexos em dissolução e moléculas que apresentam conjugação. Esta técnica pode ser usada em determinações qualitativas e quantitativas.

Esta técnica é muito usada em laboratórios de controle de qualidade, pesquisa e desenvolvimento de análises clínicas e toxilógicas.
Uma larga aplicação na indústria química, é nas análises de águas : potável, caldeiras , resfriamento e na preparação de água desmineralizada, onde se determina principalmente ferro, sulfatos, fosfatos, cor Apha e outras.


ACESSÓRIOS PARA A LEITURA DA AMOSTRA


·  Cubetas para amostras: São pequenos recipientes usados para realizar as leituras das amostras e padrões. São fabricadas em quartzo, onde abrangem a região visível e ultravioleta e sílica que trabalha apenas na região do visível. Existem vários tamanhos de cubetas, que definem o seu caminho ótico: 1 cm, 10 cm e 50 cm. A mais utilizada é a cu beta de 1 cm(10 mm).


CALIBRAÇÃO DO ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS

 A calibração do comprimento de onda dos espectrofotômetros na região do ultravioleta e visível, é realizada com a utilização do arco de quartzo-mercúrio e um filtro de vidro de óxido de holmium, comumente usados como padrão.


DETECTORES




Os detectores são os responsáveis pela detecção dos componentes de uma amostra. Eles medem e indicam a intensidade de luz que passa através da cubeta.
 São os transdutores que convertem energia radiante em sinal elétrico.
A escolha do comprimento de onda é importante pois, e depende do material a ser analisado.A fonte de radiação (lâmpada) será selecionada de acordo com o poder de absorção da substância a ser determinada,que compõe a amostra.

As principais características dos detectores que devem ser consideradas são as seguintes: seletividade,sensibilidade,resposta,ruído/quantidade mínima detectável e linearidade.

Os detectores de radiação usados para operar na região do ultravioleta e visível são os seguintes:


· células voltaicas : a energia radiante gera uma f.e.m na interface de um semicondutor e um metal.
· células fotoelétricas: a energia radiante provoca a emissão de elétrons a a partir de uma superfície sólida.
· tubos fotomultiplicadores: São células fotomultiplicadoras de múltiplos estágios . Elas são muito usadas.


SSOLVENTE GRAU ESPECTROFOTOMÉTRICO






  Os solventes utilizados pra as análises espectrofotométricas devem ser de alta pureza pois o composto a ser determinado não deve sofrer alterações químicas e nem físicas , durante a sua leitura no equipamento.Os solventes são selecionados de acordo com o composto a ser analisado.
A sua composição química deverá ser a mesma tanto na amostra como no padrão usado na preparação da curva de calibração , para reduzir os efeitos de substâncias interferentes.

Os solventes deverão ser transparentes na região espectral de interesse. Água, álcool de baixo peso molecular , clorofórmio , hidrocarbonetos alifáticos e muitos outros solventes orgânicos, podem ser usados como solvente para medidas no ultravioleta e visível.


ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO



Representa as diferentes regiões de bandas e natureza das alterações provocadas pela radiação correspondente.

A luz visível representa apenas uma banda muito estreita do espectro eletromagnético e considera-se que esta está compreendida entre 380 e 780 nm (3800 e 7800 ângstron).

A luz ultravioleta corresponde a região do espectro entre 210 e 380 nm (2100 e 3800 ângstron).

Na região do ultravioleta e do visível ocorrem as transições atômicas ou moleculares: elétrons de valência e excitação eletrônica.

Os solventes deverão ser transparentes na região espectral de interesse. Água, álcool de baixo peso molecular , clorofórmio , hidrocarbonetos alifáticos e muitos outros solventes orgânicos, podem ser usados como solvente para medidas no ultravioleta e visível.


ESPECTRO ELETROMAGNÉTICO



Representa as diferentes regiões de bandas e natureza das alterações provocadas pela radiação correspondente.

A luz visível representa apenas uma banda muito estreita do espectro

Espectro Eletromagnético REPRESENTANDO OS COMPRIMENTOS DE ONDA EM UNIDADES DIFERENTES.

Espectro Eletromagnético representado a variação da   freqüência  X comprimento de onda

Espectro Eletromagnético representado  freqüência  X comprimento de onda e

 Energia X comprimento de onda


O ESPECTROGRAMA




O gráfico gerado durante uma análise espectrofotométrica, resultada num gráfico de transmitância ou absorbância, que está relacionado com a concentração da espécie absorvente.


TERMOS MAIS USADOS NA ESPECTROFOTOMETRIA

Para se trabalhar com espectrofotometria ou outra técnica de análise instrumental,é necessário que conheçamos,pelo menos , os termos técnicos mais empregados,pois nos ajudará no momento em que precisarmos da opinião de outro profissional,quando tivermos uma dúvida ou problema.Veja abaixo uma tabela que poderá ajudá-lo.

ABSORBÂNCIA-   é o logaritmo na base 10 do recíproco da transmitância.É também chamada de densidade ótica.
TRANSMITÂNCIA-   é a proporção da força radiante transmitida por uma amostra pela força radiante incidente sobre a amostra.A unidade de transmitância é a porcentagem.
LEI DE LAMBERT-BEER-   A absorbância de uma amostra homogênea contendo uma substância absorvente, é diretamente proporcional a concentração. da substância absorvente.
COMPRIMENTO DE ONDA-   A distância , medida através da linha de propagação, entre dois pontos que estão em fase sobre ondas adjacentes expressas pelas seguintes unidades: nm ou um.
ABSORTIVIDADE MOLAR-   É o produto entre a absortividade ‘a’ e a massa molecular da substância.
FREQUÊNCIA-   É o número de ciclos por unidade de tempo.
POSIÇÃO ESPECTRAL-   É o efeito comprimento de onda ou número de onda de um feixe monocromático da energia radiante.
ABSORTIVIDADE-   É A razão da absorbância dividida pelo produto da concentração de uma substância ( em gramas por litro g/l ), e a amostra com caminho ótico (em cm)
ÂNGSTRON-   É a unidade de comprimento igual à 1 /6438.4696 do número de onda ou a linha vermelha do Cd.Para finalidades práticas, ela é considerada igual a 10E-8cm.
ESPECTRO DE ABSORÇÃO-   um gráfico de absorbância ou outra função de absorbância versus o comprimento de onda ou outra função do comprimento de onda.
SOLUÇÃO EM BRANCO-   Solução de referência preparada contendo todos os reagentes e com igual diluição, usada para zerar o espectrofotômetro antes da leitura de uma amostra ou padrão.
LINHA DE BASE-   Uma linha desenhada num espectro de absorção para representar um ponto de referência estável uma função incidente de força radiante sobre uma amostra num dado comprimento de onda ou frequência.
MICRÔMETRO-   Unidade de comprimento(um) igual à 10E-6 metros.
CONCENTRAÇÃO-   Quantidade da substância contida numa quantidade de amostra.Em espectrofotometria de absorção é usualmente expressa em gramas por litro (g/l).
AMOSTRA PADRÃO-   Um material de composição definida com semelhança química e material de natureza física , com o qual o analista espera ser ideal,e dos quais é empregado para calibração.
NANÔMETRO-   Unidade de comprimento igual a milésima parte do micrômetro.É aproximadamente , mais não exatamente , igual a 10 ângstrons ou 10-9cm
BANDA DE ABSORÇÃO-   Uma região do espectro de absorção da qual a absorbância atinge o máximo.
RESOLUÇÃO- A ASTM define resolução como o mínimo intervalo de comprimento de onda entre bandas de absorção estreitas que podem ser separadas pelo espectrofotômetro.
LBE Largura da banda espectral .- É a medida da pureza espectral ou monocromaticidade.
CROMÓFORO-Parte da molécula que absorve a radiação à um determinado comprimento de onda.


A PREPARAÇÃO DE UM PADRÃO ESPECTROFOTOMÉTRICO

Para se trabalhar com espectrofotometria, utilizando um método quantitativo, é necessário que façamos uma calibração com padrões cujas concentrações de componentes sejam próximas as da amostra que iremos analisar.A preparação de um padrão espectrofotométrico não é tarefa difícil de se realizar porém, é necessário que antes da preparação, conheçamos algumas propriedades dos componentes que farão parte deste bem como , para definir a sua composição ,a origem da amostra que será analisada.
As purezas de todos os reagentes, deverão ser conhecidas.
Todos os solventes empregados ,deverão ser de grau espectrofotométrico e a água destilada ou a mais pura possível.Abaixo você encontra um procedimento de determinação de determinação de fosfato em águas de caldeira . As leituras de absorbância são ilustrativas.

PROCEDIMENTOS

Para se preparar de um padrão espectrofotométrico necessitamos realizar os seguintes passos:

1)  selecionar os reagentes que farão parte do padrão com suas respectivas purezas conhecidas.
2)  selecionar os materiais e equipamentos que serão usados: seringas,balança analítica,papel absorvente,e o recipiente onde será preparado o padrão( frasco).Todo o material utilizado deverá ser limpo com detergentes ou com solução sulfocrômica , para que todo material orgânico seja eliminado e,após a lavagem,secar em estufa à 100oC POR 1 hora.
3)  Com base na provável concentração dos componentes da amostra, preparar uma solução padrão de trabalho, que servirá para a preparação dos padrões da curva de calibração. Este procedimento facilita a preparação dos padrões, que necessitará apenas de diluições.

A solução padrão de estoque, deverá ser preparada pesando-se , 0,7165g de di-hidrogênio fosfato de potássio ( KH2PO4), previamente seco entre 110-115 0C durante uma hora, e resfriado no dessecador por 20 minutos.Dissolver com água destilada , transferir par balão volumétrico de 100 ml e completar o volume. 1ml desta solução corresponde a 0,5 mg de PO4. Armazenar esta solução em frasco de polietileno.

Diluir a 25 ml da solução padrão de estoque,em um balão volumétrico de 250 ml em água destilada.Esta será a solução de trabalho na qual 1mml corresponde a 0,05 mg de PO4.
A cubeta deverá ser lavada com a solução para leitura. Pelo menos três lavagens.

Veja abaixo a tabela de diluição.

TABELA-1 : Preparação dos padrões a partir da solução trabalho.Diluídos em balões volumétricos de 50 ml.

CONDIÇÕES DE ANÁLISE NO ESPECTROFOTÔMETRO DE DUPLO FEIXE: comprimento de onda= 420 nm , cubeta de 1 cm e fenda=1 nm.

LEITURA DAS ABSORBÂNCIAS DOS PADRÕES

Após o ajuste do equipamento,para as condições acima citadas, preparar os padrões para a leitura . Adicionar em cada balão de padrão e num balão que será o branco, 10 ml de solução de vanadomolibdato de amônio completando em seguida, o volume com água destilada.Homogeneizar as soluções.Esperar 20 minutos para o desenvolvimento da cor. Medir a absorbância de cada padrão , zerando o aparelho com a solução em branco , tomando a mesma como referência. Traçar um gráfico lançando em ordenadas os valores correspondentes às absorbâncias e nas abcissas os valores das concentrações individuais dos padrões do fosfato.

TABELA-2 :


CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO_MÉTODO DA ABSORTIVIDADE


A forma mais simples , de se construir a curva de calibração, é calcular a absortividade da espécie química a cada concentração , e no final tira-se a média destes. A absortividade , neste caso é calculada dividindo-se cada valor individual de concentração pela sua respectiva absorbância seguindo a fórmula:

Absortrividade=absorbância / concentração X d
Onde: d= espessura da célula igual a 1cm.

A média séra igual a : absortividade(mg/l) ou ppm=0,015



EXEMPLO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE FOSFATO NUMA AMOSTRA





Os procedimentos para a análise da amostra são os seguintes:

1_Filtrar 10 ml da amostra para um balão volumétrico de 50 ml ;
2_adicionar 10 ml da solução de vanadomolibdato de amônio ;
3_ agitar para homogenizar a amostra; completar o volume até a marca com água destilada; aguardar 20 minutos para o desenvolvimento da cor e
4_fazer a leitura da amostra, nas mesmas condições que foram feita a leitura dos padrões. Uma solução em branco deverá ser preparada para zerar o equipamento, antes da leitura da amostra.

Cálculo da concentração do fosfato

 Abaixo encontramos o cálculo para determinar a concentração de fosfato de uma amostra desconhecida , a partir da absortividade do fosfato , utilizando uma cubeta de 1cm .Veja abaixo a fórmula de cálculo da concentração de fosfato.

A concentração do fosfato da amostra é com relação a uma leitura de absorbância igual a 0,258.

Concentração (mg/l) ou ppm=absorbância / absortividade
Concentração (mg/l) ou ppm=0.258 / 0,015
Concentração (mg/l) ou ppm=17,2


CONSTRUÇÃO DA CURVA PELO EXCEL





Exemplo de uma Seqüência da construção:

1) digitar em duas colunas paralelas os valores das concentrações e das respectivas absorbâncias dos padrões.Veja a tabela abaixo.




2) com a utilização do mouse, selecionar todos as colunas da tabela elaborada.




3) clicar no ícone de construção de gráficos no EXCEL.
4) selecionar o tipo dispersão , o primeiro subtipo que compara pares de valores e clic com o mouse em avançar duas vezes.
5) digitar em título do gráfico : CURVA DE FOSFATO EM ÁGUAS
6) digitar em eixo dos valores(x): CONCENTRAÇÃO( ppm).
7)digitar em eixo dos valores (y): ABSORBÂNCIA, e em seguida clic em avançar ,em seguida clic com o mouse em concluir.





8) expandir a área do gráfico ,para uma melhor visualização, através do arraste do mouse.
9) com a ajuda do mouse, clic num dos pontos da curva no gráfico.Todos os pontos da curva ficarão amarelos.

10) clic em gráfico na barra superior e na janela que abre, clic em adicionar linhas de tendência. Na tela que abre , selecionar a opção linear.
11) clic na tela adicionar linhas de tendência, em opções. Marque os campos: definir interseção =0 , exibir equação no gráfico e exibir valor de R-quadrado no gráfico. Clic em OK. Para um melhor destaque dos valores de Y e R2, marque a área destes e clic em cor do preenchimento (selecione a sua cor) na barra superior do EXCEL.




12) Calcular a concentração do fosfato na amostra.



CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DO FOSFATO


 Abaixo encontramos o cálculo para determinar a concentração de fosfato de uma amostra desconhecida , a partir da absortividade do fosfato , utilizando uma cubeta de 1cm .Veja abaixo a fórmula de cálculo da concentração de fosfato.

A concentração do fosfato da amostra é com relação a uma leitura de absorbância igual a 0,258.

ppm FOSFATO = ABSORBÂNCIA * 66,667
ppm Fe = 0,258 *66,667= 17,20ppm ou mg/l



ANÁLISE QUANTITATIVA POR ADIÇÃO DE PADRÃO


A Determinação da concentração de uma substância através da adição de padrões,consiste em elaborar padrões a partir da própria amostra ,seguindo as seguintes etapas:

1) obter o espectro da substância já conhecida,
2) medir a absorbância da banda do espectro, escolhida referente ao que se deseja quantificar,
3) preparar os padrões, adicionando-se quantidades conhecidas da substância pura,
4) fazer a leitura de cada padrão , e através dos espectros obtidos, medir a absorbância de cada um . Anotar os valores.
5) traçar um gráfico de ABS em função da quantidade de substância adicionada,
6) extrapolar a curva obtida até a intersecção com o eixo X, encontrando-se o valor da substância na amostra.

Traçar um gráfico lançando em ordenadas os valores correspondentes às absorbâncias e nas abcissas os valores das concentrações individuais dos padrões.Veja um exemplo abaixo.


BIBLIOGRAFIA

ESPECTROFOTOMETRIA UV-VISÍVEL

Autor(ES) Compilado e adaptado por Eleno Paes Gonçalves

Editora , Edição , Ano (ES)INTRALAB, Curso realizado em 1985

FUNDAMENTOS DE ANÁLISE INSTRUMENTAL

Otto Alcides Ohweler

Editora Livros Técnicos e Científicos Editora S.A, Edição – Lisboa, 1981

QUÍMICA ANLÍTICA QUANTITATIVA

Autor(ES)Otto Alcides Ohweler

Editora Livros Técnicos e Científicos S.A , Edição 1976 , Ano – 1976,  Vol-3