Cromatografia por Permeação de Gel



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CONCEITO BÁSICO


  A cromatografia por permeação de gel pode ser denominada, como um método puramente mecânico de separação,na qual os componentes de uma amostra a serem separados,são excluídos de acordo com o tamanho da sua cadeia química, numa fase estacionária (uma matriz, com partículas de diâmetro,forma e tamanho uniformes,que fica impregnado na coluna) e arrastado por uma fase móvel (um solvente com capacidade de solubilizar totalmente a amostra),que flui através da primeira.

  A Fase Estacionária é apenas um suporte,feito de um polímero de alto peso molecular, que possui ligações cruzadas, e os seus poros servem para separar as moléculas da amostra de acordo com o seu tamanho.. As moléculas maiores são excluídas e eluem primeiro, mas as menores , que penetram nos poros , são retidas por mais tempo.

  É também conhecida com os nomes de cromatografia de filtração em gel,  cromatografia de peneira molecular de difusão restrita ou cromatografia de exclusão por tamanho.

  A cromatografia por permeação de gel, é um método relativo de determinação da massa molecular dos polímeros. Os resultados obtidos , são relativos aos tempos de retenção de um padrão monodisperso ou polidisperso, por exemplo o  poliestireno monodisperso, a partir de uma curva de calibração massa molecular versus tempo de retenção.


APLICAÇÕES DA TÉCNICA


  As aplicações da cromatografia por permeação de gel são inúmeras.Talvez a sua maior seja na análise de polímeros naturais ou sintéticos.

  A aplicação desta técnica é para determinação de compostos que possuem pesos moleculares abaixo de 1000 ou acima de milhões de peso molecular(g/mol)com a utilização de colunas com fase estacionária de partículas variáveis.

  É necessário que estes compostos poliméricos,sejam totalmente solúveis na fase móvel em uso.


O CROMATÓGRAFO


  É a denominação dada ao aparelho que realiza as análises cromatográficas.

  Um cromatógrafo,basicamente,consiste nas seguintes partes e suas respectivas finalidades:

·  Reservatório de Fase Móvel(solvente): Armazenar o(s) solventes que será a fase móvel do sistema.Esta deverá ser de pureza HPLC e filtrada antes de entrar no sistema.

·  Bomba:Movimentar a fase móvel pelo sistema cromatográfico à pressão e vazão controladas.

·  Injetor:Conduzir o volume de amostra conhecido, para dentro do sistema loop e coluna , até o detector.

·  Forno:Manter a amostra numa temperatura pré-selecionada para operação.

·  Detector:É o olho do cromatógrafo.É o responsável pela detecção dos componentes de uma amostra.O mais utilizado é o detector de índice de refração.

·  Coluna:É o coração do cromatógrafo.É nela onde ocorre a separação dos componentes de uma amostra.

·  Integrador ou computador:É o responsável pela integração dos picos,que gerarão um gráfico denominado cromatograma.


INJETORES



  O injetor é uma válvula que possui um loop com capacidade de volume escolhida pelo operador, que coloca a mostra líquida no sistema. Esta válvula pode trabalhar manualmente ou através de um sistema automático (injetor automático).O seu funcionamento correta, garantirá uma análise quantitativa sem problemas de repetibilidade e reprodutibilidade da injeção.


  Os injetores são muito importantes para realizar uma análise cromatográfica.Eles operam na temperatura ambiente.É importante que este não esteja com vazamentos pois, poderá entra bolhas de ar na coluna.


   A velocidade de injeção na válvula poderá , se for muito lento,parar a bomba devido à alta pressão.Quando encher o loop ,com o auxílio de uma seringa, gire rapidamente a válvula de injeção.

Na entrada do injetor existe uma peça cujo material poderá ser danificado por pressão sobre ela, se ao injetar , você não retirar a seringa.
   A válvula de injeção mais usada é a RHEODYNE.



COLUNA


   A coluna cromatográfica é a responsável pela separação dos componentes de uma amostra. É um tubo com um diâmetro interno  que varia de 1 a 6 de mm e o tamanho de 10 a 37 cm.

  As colunas possuem filtros nas suas duas extremidades para protegê-la de substâncias que possam danificá-las,e uma seta que indica qual deverá ser o sentido do fluxo de operação do solvente ao instalá-la.Normalmente empregam-se colunas menores, pré-colunas (ou colunas guardas ou de sacrifício) para reter partículas grandes que danificariam a coluna.

  O peso molecular do polímero e a sua curva de distribuição molecular , é quem indicam qual o  tamanho de poro devemos usar, para que a exclusão aconteça, e o número de colunas necessário para se tenha um cromatograma .


   O volume de amostra injetado na coluna dependerá da viscosidade que este material apresente, que depende ,diretamente ,do seu peso molecular.

     O material utilizado para a confecção das colunas, é o aço inoxidável.O diâmetro das partículas de empacotamento das colunas muito importante na separação dos componentes de uma amostra, o mais usual é o de 5um.

 

A SELEÇÃO DAS COLUNAS PARA A SEPARAÇÀO

  A seleção das colunas , depende da massa molecular do polímero a ser analisado e também da sua polidispersão que determinará a quantidade de colunas.

  Geralmente para os polímeros comerciais , selecionam-se 04 colunas (500 , 10e3, 10e4, 10e5  ângstrons), para a obtenção do peso molecular.

  Abaixo, encontramos o exemplo de uma tabela comumente usada, que relaciona a porosidade das partículas da fase estacionária, com a faixa de massa molecular do polímero que deverá resultar numa boa separação.

Faixa de massa molecular (g/mol)     Porosidade em ângstron(Ao)

100 - 1000                                                      50

1000 - 18000                                                500

10000 - 200000                                           10e4

500000 - 20000000                                     10e7


DETECTORES


  Os detectores são os responsáveis pela detecção dos componentes de uma amostra. Eles medem e indicam a variação da composição da fase móvel ao sair da coluna cromatográfica, através de um sinal elétrico.

  Os detectores mais usados são os seguintes: Ultravioleta Visível (UV-VIS) e Índice de Refração.O Índice de Refração é considerado um detector universal.

  A escolha do detector é importante e depende das características do material a ser analisado como:absorção no ultravioleta e sensibilidade no índice de refração.

  As principais características que devem ser consideradas são as seguintes: sensibilidade,detectabilidade,linearidade,repetibilidade,forma do pico e facilidade de operação.

ULTRAVIOLETA E VISÍVEL(UV-VIS)

  São os detectores que se baseiam na absorção da luz pela amostra quando se faz passar por ela , uma radiação eletromagnética num dado comprimento de onda. Com a mudança do comprimento de onda , é possível aumentar a sensibilidade para uma dada substância.

  A utilização de solventes de grau espectrofotométrico é muito importante, para uma análise confiável.

  Esses detectores são muito sensíveis.São os mais usados na aplicação desta técnica. É compatíveL com a técnica de eluição gradiente.

  Os detectores espectrométricos são de dois tipos , encontrados no mercado: com comprimento de onda fixo e comprimento de onda variável.

ÍNDICE DE REFRAÇÃO

 O seu funcionamento baseia-se na diferença de índice de refração do componente com relação ao índice do solvente puro.

  São detectores que operam que monitora continuamente a diferença do índice de refração entre a célula de referência (com o solvente) e a célula de amostra (com o solvente e a fase móvel).

  Este detector é usado, quando os solutos não absorvem na região ultravioleta e na região visível.O detector tipo Fresnel , o mais usado, fundamenta-se na lei de Fresnel , segundo a qual na interface entre o prisma de vidro e algum líquido, a quantidade de luz transmitida e refletida é proporcional ao ângulo de incidência da luz e ao índice de refração do líquido.

  É considerado universal apesar de ter uma sensibilidade moderada.Mudanças na composição do solvente ou da mistura de solvente , acarreta a variação do índice de refração. As amostras devem ser analisadas utilizando o mesmo solvente da fase móvel , bem como nos padrões de calibração.São detectores sensíveis à mudança de temperatura.


SOLVENTES- FASE MÓVEL

  Os solventes utilizados para cromatografia líquida , devem ser de alta pureza e é uma das variáveis mais importantes , que influenciam numa separação cromatográfica.Podem ser utilizados na técnica, solventes aquosos ou orgânicos bastando , que estes tenham os seguintes requisitos:

·  Ser compatível com o detector que se deseja operar.

·  Ter capacidade de solubilizar a amostra totalmente.

·  Possuir baixa viscosidade pois, trabalhará em alta pressão.

·  Não alterar as características de separação da fase estacionária da coluna.

·  Ser seguro para manuseá-lo e viável.

·  Não ser muito volátil, possuir um ponto de ebulição adequado para se trabalhar.

·  Ter elevado grau de pureza pois, a detecção de um componente poderá ser afetada.

VAZÃO DE OPERAÇÃO DOS SOLVENTES



  A vazão do solvente é muito importante na cromatografia líquida pois esta deverá ser muito estável, para não afetar a separação dos componentes na coluna.

  Geralmente opera-se um cromatógrafo líquido  com a vazão de 1 ml/min.

  A vazão do solvente  pode ser medida com uma proveta graduada , coletando-se na saída do detector um volume do solvente pré-determinado.

  O cálculo da  vazão é  feito através do tempo que se gasta para coletar 1 ml do solvente.

  Exemplo de cálculo na proveta: para a medição da vazão de 1ml/min , num volume escolhido de 5ml , o tempo de escoamento do gás será de 300s.

  Confira o resultado,utilizando a fórmula abaixo.

VAZÃO(ml/min) =60(s) X VOLUME ESCOLHIDO NA PROVETA(ml)
                                                                 
TEMPO DE ESCOAMENTO(S)
 


O GRÁFICO GERADO - CROMATOGRAMA



ALGUNS TERMOS TÉCNICOS MAIS UTILIZADOS NA CROMATOGRAFIA


  Para se trabalhar com cromatografia ou outra técnica de análise instrumental,é necessário que conheçamos,pelo menos alguns dos termos técnicos mais empregados,pois nos ajudará no momento  em que precisarmos da opinião de outro profissional,quando tivermos uma dúvida ou  problema.Veja abaixo uma tabela que poderá ajudá-lo.


TERMOS TÉCNICOS e SIGNIFICADOS

UV-CUT-OFF- É o comprimento de onda onde um solvente absorve mais que uma unidade de absorbância , numa cela de 1 cm de caminho ótico.

Microlitro-Unidade de volume que se trabalha na cromatografia que corresponde a 1/1000 litros.

Pico Fantasma-Pico indesejável que aparece no cromatograma de uma amostra.Pode ser oriundo da amostra ,da coluna ou um problema de detecção.

Fase Móvel-É o solvente  que conduz a amostra para a coluna até o detector

Fase Estacionária-Um material sólido, que preenche as colunas , responsáveis pela separação ou não de um componente, o qual dependerá de do volume hidrodinâmico da molécula analisada.

Resolução- É a medida do grau de separação entre o máximo dos picos e a largura das bandas

Linha de Base    É a linha gerada no gráfico , quando da passagem apenas do solvente no detector. O ideal é que seja uma linha reta.

Cromatograma  Gráfico gerado pelo integrador ou computador, que normalmente apresenta os picos dos componentes, suas áreas, as suas concentrações e o tempo de retenção de cada um.

Ruídos- São sinais observados na linha de base de uma amostra ou da passagem do solvente no seu cromatograma, enxergados pelo detector.

Eluição do Pico-                                                                                               É a saída,o aparecimento do pico, após a passagem por uma coluna, de um dado componente de uma amostra.

Filtro de Linha- É filtro feito com uma tela porosa de aço utilizado antes da pré-coluna , ou em outras partes do aparelho, usado para reter partículas sólidas.

Pré-Coluna- É uma pequena coluna , utilizada antes da coluna cromatográfica, que tem a função de reter partículas oriundas da amostra ou do solvente , para evitar que danifique a coluna.

Microseringa- Seringa graduada em microlitros utiliza para injetar as amostras líquidas ou gasosas.

Degaseificação da Fase Móvel- É a retirada de gases dissolvidos no solvente através de técnicas de aquecimento ou ultra-som.

Mw- É o peso molecular médio numérico.Depende do número e do peso das moléculas .Pode ser obtido por espalhamento de luz(light scattering)

Mn - É o peso molecular médio ponderal.É determinado por osmometria de pressão.O valor é dependente do número de moléculas presentes no sistema.A técnica é baseada em propriedades coligativas.

Pd- Polidispersão .É a razão entre Mw/Mn.

Mz- É o peso molecular médio . É obtido por ultracentrifugação.

MZ+1- É o peso molecular médio Z+1.É obtido por ultracentrifugação.

Mp-É o peso molecular na altura máxima do pico, seu ápice.

Polímero polidisperso- É a denominação  dada ao polímero que na qual, razão entre Mw/Mn é um valor alto , devido à variação das massas moleculares na sua cadeia .

Polímero monodisperso- É a denominação  dada ao polímero que na qual, razão entre Mw/Mn é um valor próximo de 1 , devido à uniformidade  das massas moleculares na sua cadeia .

Calibração Universal- É o método de calibração introduzido por BENOIT que utiliza o conceito de volume hidrodinâmico da molécula do polímero.                                                                                   

Calibração Relativa- narrow standard- É o tipo de calibração que está relacionado com a posição de cada padrão na curva de calibração, ou seja , o volume de retenção  de diferentes pesos moleculares com o tempo de eluição de cada um.      

Calibração broad-MWD standard-É um método de calibração que requer que a completa curva de distribuição do polímero seja conhecida.Para uma curva de distribuição de um polímero conhecido existe uma única correspondência entre a massa molecular e a fração da massa do polímero .

Constante  ‘K “e constante” alfa “- São as constantes empíricas de MARK-HOUWINW ,obtidas através da determinação da viscosidade intrínseca do polímero que , varia com o tipo de polímero, solvente e temperatura”.

Volume de Exclusão-Volume de retenção de uma molécula numa fase estacionária onde de todas as moléculas grandes, maiores que o tamanho dos poros da fase são excluídas.                                 

 Volume de  Permeação- Volume de retenção das moléculas que passam através dos poros da fase estacionária.

 Volume hidrodinâmico –

 MVD- É a distribuição da massa molecular das moléculas numa amostra de polímero.

 Resolução- É a habilidade de uma coluna, de separar cromatograficamente picos.

 Volume morto- É o volume total da fase móvel na coluna.

 Volume de eluição- É o volume do eluente , que carrega as moléculas da substância através da coluna.

 Seletividade- É o fator de separação , a medida da retenção relativa dos picos de duas substâncias num   cromatograma.

 ‘PS-DVB- É o poliestireno divinilbenzeno, o mais comum polímero usado como fase estacionária em   cromatografia por permeação de gel.


A PREPARAÇÃO DE UM PADRÃO CROMATOGRÁFICO


  Para se trabalhar com cromatografia  por permeação de gel, é necessário que preparemos uma curva de calibração com polímeros padrões. O poliestireno é o padrão mais usado.Estes padrões podem ser encontrados na forma de polímeros monodisperso ou polidisperso .

  A seleção do número de padrões que iremos utilizar na construção da curva de calibração , dependerá do peso molecular  da amostra , bem como da polidispersão deste.

PROCEDIMENTOS

Para se preparar de um padrão cromatográfico para GPC,necessitamos realizar os seguintes passos, por exemplo, para a calibração com poliestireno.

  1. selecionar os padrões de acordo com a sua massa molecular(g/mol),por exemplo:2000,5000 , 8000,20000,35000,55000,80000,110000,135000,170000,300000,520000,750000,1000000 e 1350000.
  2. Preparar, formando conjuntos de pesos moleculares com diferenças entre si expressivas, adicionando em balões volumétricos de 100ml.Abaixo , veja uma maneira de seleção.

             ·   PADRÃO -A: 5000,55000,170000 e 1350000 (g/mol)

             ·  PADRÃO -B: 8000,135000 e 1000000 (g/mol)

 ·  PADRÃO -C: 20000,110000 e 520000 (g/mol)

 ·  PADRÃO- D: 2000,80000,300000 e750000 (g/mol)

  • Pesar as massas dos padrões, de tal maneira que cada conjunto de padrões preparados, não ultrapasse a  concentração do polímero a analisar (ex:0.25% massa do polímero /volume do solvente).Abaixo, veja um exemplo:

       ·  PADRÃO -C: 20000,110000 E 520000 (g/mol) dissolvido em 100ml de solvente.

massa a pesar -  “PS=20000     =  0.083g

                         ‘PS=110000    =  0.083g

                         ‘PS=520000    =  0.083g

                          massa total    =   0.249g

conclusão: a massa utilizada de 0.2500g/100ml do solvente, foi dividida pelo número de padrões usados.

  • Completar o volume de cada um dos conjuntos, com o solvente e colocar em repouso , para a sua completa dissolução, durante pelo menos 06 horas.
  • Filtrar uma porção de cada conjunto de padrões e injetá-los , numa seqüência ininterrupta.

TABELA-1 : Conjunto de padrões: a,b,c e d. Valores dos padrões expressos em g/mol


Conjuntos____Padrão-1____Padrão-2____Padrão-3____Padrão-4 

  a_____________5000________55000________170000______1350000

  b____________  8000_______135000_______1000000

  c ___________ 20000______  110000________520000

  d ____________2000________ 80000 _______ 300000______ 750000

TABELA-2 : Tabela peso molecular e volume de eluição de cada padrão após a injeção :Valores para efeito de ilustração.

PESO MOLECULAR(g/mol)     Volume de eluição(min)

1350000                                                 23.00

1000000                                                 23.45

750000                                                  24.35

520000                                                  24.95

170000                                                  25.70

135000                                                  25.95

110000                                                  26.20

80000                                                    27.00

55000                                                    28.10

20000                                                    29.20

8000                                                      29.90

5000                                                      30.40

2000                                                      31.85

CALIBRAÇÃO  UNIVERSAL_NARROW STANDARDS

  O método de calibração universal  introduzido por BENOIT et al  , utiliza o conceito de volume hidrodinâmico da molécula do polímero.O volume hidrodinâmico pode ser expresso em termos do produto da massa molecular M e  a viscosidade intrínseca [n] da amostra do polímero.

  A viscosidade intrínseca de um polímero é uma quantidade experimental derivada da  medida da viscosidade em solução do polímero. 

  Em geral os dados da curva de calibração , são plotados usando-se o log(n)M  versus o volume de retenção , ao invés do logM versus volume de retenção.

CALIBRAÇÃO  RELATIVA- NARROW STANDARD

 É o tipo de calibração que está relacionado com a posição de cada padrão na curva de calibração, ou seja , o volume de retenção  de diferentes pesos moleculares com o tempo de eluição de cada um.  

 Este tipo de calibração utiliza padrões estreitos.

 Não pode ser usado para analisar todos os tipos de polímeros pois, o polímero utilizado como padrão é o poliestireno. 

 É o tipo de calibração mais usado nesta técnica mas, os pesos moleculares obtido são relativos,exceto , para o poliestireno , se usarmos os padrões de calibração do polímero.

 Em geral , a  curva é calculada através do polinômio de terceira ordem, cúbico.

 Esta curva apresenta o seguinte gráfico:

 log(M) X Ve

Onde:

Log(M)= Logaritmo da massa molecular de cada padrão

  Ve    = Volume de exclusão de cada padrão (o tempo em são eluidos em minutos).

 

 

 

CÁLCULOS MANUAIS PARA OBTENÇÃO DOS PESOS MOLECULARES

Item para ser refeito _entrará depois _eliminar do site

  Em geral , a  amostra é calculada por uma curva obtida pelo uso do polinômio cúbico de terceira ordem.Os pesos moleculares são obtidos , atualmente,através dos cálculos realizados por um  software que acompanha o equipamento .Antes , os pesos moleculares eram calculados manualmente.

CÁLCULOS PARA OBTENÇÃO DAS MASSAS MOLECULARES

 Um polímero é constituído de várias macromoléculas de diferentes massas moleculares que em GPC, dá  origem a um gráfico denominado de distribuição de peso molecular (DPM). Essa distribuição está relacionada com o tipo de processo usado na polimerização do(s) monômero(s).

  O gráfico nos mostra a separação do polímero dos oligômeros, monômeros e aditivos empregados para a sua fabricação.

 Nos sistemas atuais de GPC , com a utilização de softwares , consegue-se realizar cálculos de diversas massas moleculares e relações entre elas, tais como: Mw , Mn, Mz, MZ+1, Mv , Pd , Mz/Mw Mz+1/Mw.

 É possível , também, com estes softwares, realizar a correção da DPM , devido à pequena variação de fluxo, com a utilização de um padrão de baixo peso molecular, que seja totalmente permeado, adicionado nos padrões de calibração e no solvente de preparação da amostra.

  Os pesos moleculares dos polímeros em GPC, são médias de uma mistura de diversos pesos que podem ser determinados por outras técnicas analíticas.

Observe a tabela abaixo, que se refere aos diversos pesos e técnicas empregadas para a sua  determinação.

O significado de cada item nas fórmulas é o seguinte:

N = número de moléculas

M = peso molecular

α =  constante de MARK-HOURKING

A polidispesão (Pd) é dada pelo coeficiente entre o Mw e o Mn.

Pd= Mw

        Mn

Na DPM , a relação dos pesos moleculares, pelo valor do peso de cada um, é a seguinte: 

Mn < Mv < Mw < Mz < Mz+1


CONCENTRAÇÃO PARA A PREPARAÇÃO DE PADRÕES E AMOSTRAS


PADRÕES

 A concentração da solução para a preparação de um padrão , deverá ser estabelecida de acordo com o sinal obtido no detector em uso, ou seja, o sinal obtido deverá ser suficientemente maior que o sinal do ruído da linha de base.Este diferença de sinal é observada com mais precisão,  ampliando-se a linha de base juntamente com o pico do padrão obtido.

AMOSTRAS

 A concentração da solução para a preparação de uma maior amostra , é orientada com todas as recomendações feitas , na preparação de um padrão. Esta concentração deverá ser igual para a preparação de todas as amostras, na ocasião onde iremos comparar amostras de um mesmo polímero.

Em literaturas , encontramos tabelas que relacionam a faixa de massa molecular com faixa de concentração  que deveremos operar em unidades de concentração por volume do solvente.Um exemplo de relação é dado abaixo.

Mw                                               Concentração

100000 – 500000                     0,07 à  0,10 %

 

10000 – 5000                          0,13 à  0,16 %

  O mais importante é que as colunas cromatográficas não sejam, desnecessariamente, sobrecarregadas e que a concentração usada , não cause interferências na separação das massas moleculares.

  Outro fator importante, é que se a concentração da amostra for muito elevada, aumentará a pressão do sistema causando danos neste.

 

 


A IMPORTÂNCIA DA ANÁLISE DO GPC

  A análise de GPC , é uma técnica de análise instrumental muito importante para o estudo dos polímeros, por causa da sua funcionalidade na determinação da curva de distribuição de peso molecular.

  Durante uma reação de polimerização, pode-se fazer o controle da transformação do monômero.

  As propriedades dos polímeros, são largamente afetadas pela distribuição de peso molecular(DPM) de um polímero pois, um polímero pode apresentar um mesmo Mw com diferente DPM.

  Algumas propriedades abaixo  são afetadas nos polímeros, como:

             ·   Tempo de cura

             ·  Dureza

 ·  Índice de fluidez

 ·  Tempo de relaxação dos elastômeros

              ·  Tensão de ruptura

              ·  outras.


 BIBLIOGRAFIA

FUNDAMENTOS DE CROMATOGRAFIA

Bonato Pierina S. C. Colins Carol H Braga Gilberto Editora Unicamp , 1ª Edição  , Ano 2006

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

CÁCULOS MANUAIS PARA OBTENÇÃO DOS PESOS MOLECULARES

Item para ser refeito _entrará depois _eliminar do site

  Em geral , a  amostra é calculada por uma curva obtida pelo uso do polinômio cúbico de terceira ordem.Os pesos moleculares são obtidos , atualmente,através dos cálculos realizados por um  software que acompanha o equipamento .Antes , os pesos moleculares eram calculados manualmente.