Cromatografia Líquida


CONCEITO BÁSICO


A cromatografia é definida como uma técnica da qual uma mistura de substâncias químicas ,podem ser separadas por em virtude de suas diferentes afinidades com relação a duas fases imiscíveis.Uma delas, a fase estacionária,consiste de um leito fixo de pequenas partículas com uma grande, enquanto a outra, a fase móvel  ou eluente que é um fluido que se move constantemente através , ou sobre a superfície da fase estacionária.  Os componentes de uma amostra a serem separados,são particionados em duas fases:uma estacionária (um líquido impregnado num suporte sólido inerte empacotado numa coluna de aço inox),e a outra uma fase móvel (um líquido),que flui através da primeira.Quando a fase líquida é uma substância polar (ex: polietilenoglicol) , e a fase móvel é apolar (ex: octadecilsilano), o processo é denominado de cromatografia de fase normal.Quando a fase estacionária é não polar (ex: octadecilsilano), e a fase móvel é polar , o processo é denominado de cromatografia de fase reversa.É técnica de análise muito rápida e eficiente.Necessita de um operador experiente para executá-la.



APLICAÇÕES DA TÉCNICA


  As aplicações da cromatografia líquida são inúmeras, tanto qualitativa como quantitativa.Dentre elas podemos destacar análises de amostras complexas : urina,sangue,alimentos,solo, derivados de petróleo,antioxidantes,pesticidas,ácidos nucléicos,polímeros e uma larga aplicação em produção de medicamentos. A aplicação desta técnica é ampla pois, é possível a determinação de uma grande quantidade de compostos químicos orgânicos e inorgânicos com pesos moleculares altos ou com uma baixa estabilidade à temperatura , que são impossíveis de analisar por cromatografia gasosa ,e apresentando enantiômeros,bastando que estes sejam solúveis na fase móvel usada .


O CROMATÓGRAFO


 É a denominação dada ao aparelho que realiza as análises cromatográficas.Um cromatógrafo,basicamente,consiste nas seguintes partes e suas respectivas finalidades:

·  Reservatório de Fase Móvel(solvente) Armazenar o(s) solventes que será a fase móvel do sistema.Esta deverá ser de pureza HPLC e filtrada antes de entrar no sistema.

·  Bomba:Movimentar a fase móvel pelo sistema cromatográfico à pressão e vazão controladas.

·  Injetor:Conduzir o volume de amostra conhecido, para dentro do sistema ( loop e coluna , até o detector ).

·  Detector:É o olho do cromatógrafo.É o responsável pela detecção dos componentes de uma amostra.O mais utilizado é o detector ultravioleta.

·  Coluna:É o coração do cromatógrafo.É nela onde ocorre a separação dos componentes de uma amostra.

·  Integrador:É o responsável pela integração dos picos,que gerarão um gráfico denominado cromatograma.


INJETORES


  O injetor é uma válvula que possui um loop com capacidade de volume escolhida pelo operador, que coloca a mostra líquida no sistema. Esta válvula pode trabalhar manualmente ou através de um sistema automático (injetor automático).O seu funcionamento correto garantirá uma análise quantitativa sem problemas de repetibilidade e reprodutibilidade da injeção.
  Os injetores são muito importantes para realizar uma análise cromatográfica.Eles operam na temperatura ambiente.É importante que este não esteja com vazamentos pois, poderá entrar bolhas de ar na coluna.
   Se a velocidade de injeção na válvula poderá , se for muito lenta , para a bomba devido à alta pressão.Quando encher o loop ,com o auxílio de uma seringa, gire rapidamente a válvula de injeção. Na entrada do injetor existe uma peça cujo material poderá ser danificado por pressão sobre ela, se ao injetar , você não retirar a seringa.
   A válvula de injeção mais usada é a RHEODYNE.


COLUNAS


  A coluna cromatográfica é a responsável pela separação dos componentes de uma amostra. É um tubo de aço com um diâmetro interno , que varia de 1 a 6 de mm variando de 10 a 13 cm.A sílica porosa ,esférica,micro particulada com substituintes quimicamente ligados pode ser usada para a cromatografia de fase reversa, normal ou de íons. .Para colunas preparativas, maior que 6mm de diâmetro e comprimentos de 25 a 30 cm.
  As colunas possuem filtros nas suas duas extremidades para protegê-la de substâncias que possam danificá-las,e uma seta que indica qual deverá ser o sentido do fluxo de operação do solvente ao instalá-la.Normalmente usam-se colunas menores, pré-colunas (ou colunas guardas ou de sacrifício) para reter partículas grandes que danificariam a coluna.A composição química da amostra é quem indica ,que tipo de fase estacionária iremos usar.
   O volume de amostra injetado na coluna dependerá da quantidade do componente que desejamos analisar e da sensibilidade do detector em uso.Em alguns casos , utiliza-se mais de uma coluna em série.
  O material utilizado para a confecção das colunas, é o aço inoxidável.O diâmetro das partículas de empacotamento das colunas muito importante na separação dos componentes de uma amostra, o mais usual é o de 5um.


DETECTORES


  Os detectores são os responsáveis pela detecção dos componentes de uma amostra durante a sua eluição. Eles medem e indicam a variação da composição da fase móvel ao sair da coluna cromatográfica, através de um sinal elétrico.

  Os detectores mais usados são os seguintes: Ultravioleta Visível (UV-VIS) e Índice de Refração.O Índice de Refração é considerado um detector universal.Não se recomenda usá-los co operação de gradientes ,porque a variação da composição da fase móvel causa a variação do índice de refração.

  A escolha do detector é importante e depende das características do material a ser analisado como:sensibilidade, detectabilidade, repetibilidade, forma do pico, vazão, temperatura e facilidade na sua operação.

  As principais características que devem ser consideradas são as seguintes: sensibilidade,detectabilidade,linearidade,repetibilidade,forma do pico e facilidade de operação.

ULTRAVIOLETA E VISÍVEL(UV-VIS)

São os detectores que se baseiam na absorção da luz pela amostra quando se faz passar por ela , uma radiação eletromagnética num dado comprimento de onda. Com a mudança do comprimento de onda , é possível aumentar a sensibilidade para uma dada substância.A utilização de solventes de grau espectrofotométrico é muito importante, para uma análise confiável.

  Esses detectores são muito sensíveis.São os mais usados na aplicação desta técnica. É compatíveL com a técnica de eluição gradiente.Os detectores espectrométricos são de dois tipos , encontrados no mercado: com comprimento de onda fixo e comprimento de onda variável.

                                                 
ÍNDICE DE REFRAÇÃO

São detectores que operam que monitora continuamente a diferença do índice de refração entre a célula de referência (com o solvente) e a célula de amostra (com o solvente e a fase móvel). Este detector é usado, quando os solutos não absorvem na região ultravioleta e na região visível.O detector tipo Fresnel , o mais usado, fundamenta-se na lei de Fresnel , segundo a qual na interface entre o prisma de vidro e algum líquido, a quantidade de luz transmitida e refletida é proporcional ao ângulo de incidência da luz e ao índice de refração do líquido.Este detector é considerado universal apesar de ter uma sensibilidade moderada.Mudanças na composição do solvente ou da mistura de solvente , acarreta a variação do índice de refração. As amostras devem ser analisadas utilizando o mesmo solvente da fase móvel , bem como nos padrões de calibração.São detectores sensíveis à mudança de temperatura.


SOLVENTES  


 Os solventes utilizados para cromatografia líquida , devem ser de alta pureza e é uma das variáveis mais importantes , que influenciam numa separação cromatográfica.Podem ser utilizados na técnica, solventes aquosos ou orgânicos bastando , que estes tenham os seguintes requIsitos: ·  Ser compatível com o detector que se deseja operar. ·  Ter capacidade de solubilizar a amostra totalmente. ·  Possuir baixa viscosidade pois, trabalhará em alta pressão. ·  Não alterar as características de separação da fase estacionária da coluna. ·  Ser seguro para manuseá-lo e viável. ·  Não ser muito volátil, possuir um ponto de ebulição adequado para se trabalhar. ·  Ter elevado grau de pureza pois, a detecção de um componente poderá ser afetada. A mistura de solventes deve ser feita com líquidos que sejam miscíveis.Um teste com uma pequena quantidade da mistura, deverá ser  realizado, para evitar o desperdício na preparação de um grande volume de solução.    A compressibilidade  afeta a exatidão absoluta das bombas e os seus níveis de pulsação.    A preparação da fase móvel é muito importante.O volume de cada solvente deve ser medido numa proveta, separadamente. Devem ser adicionados no frasco lentamente para evitar que se a quantidade de gases dissolvidos seja maior e assim, causa problemas no bombeamento.     Todo o solvente utilizado na cromatografia líquida, deve ser filtrado com membranas  de 0,2 a 0,45um de porosidade, para evitar que obstrua o sistema e o danifique.    No frasco reservatório do solvente deve se utilizar um filtro poroso de 10um.    Uma medida para usada para aumentar a reprodutibilidade e a estabilidade do detector, é desageificar a fase móvel através do borbulhamento com o gás hélio  ou de um sistema a vácuo.    Aditivos , como antioxidantes, são também usados para a preservação da fase móvel por exemplo, usa-se uma pequena quantidade de BHT no tetrahidrofurano para evitar a formação de peróxidos.    O solvente usado para fase reversa tem polaridade maior que a fase estacionária e na fase normal, a polaridade da fase estacionária é maior que a do solvente.

  A vazão do solvente é muito importante na cromatografia líquida pois esta deverá ser muito estável, para não afetar a separação dos componentes na coluna.   Normalmente opera-se com a vazão de 1 ml/min.

SEPARAÇÃO GRADIENTE

Separação usando um sistema gradiente de bombeamento da fase móvel.A composição da fase móvel varia ao longo de toda análise . É muito bom para a separação de amostras complexas ou quando as polaridades dos compostos ,a separar são muito diferentes. A polaridade  modificada , devido à força do solvente,faz com que a coluna seja limpa durante a corrida. SEPARAÇÃO ISOCRÁTICO Separação usando um sistema isocrático de bombeamento da fase móvel.A composição da fase móvel varia ao longo de toda análise .A bomba  A limitação deste sistema , é que em algumas amostras mais complexas , não é possível separar todos os seus componentes devido à polaridade do solvente da fase móvel também permanecer constante . A resolução neste caso é pequena , e os picos eluem muito rápido.


O GRÁFICO GERADO - CROMATOGRAMA


Absorbância        0,500          0,400          0,300          0,200           0,100          AU  


A PREPARAÇÃO DE UM PADRÃO CROMATOGRÁFICO   


Para se trabalhar com cromatografia líquida em análise quantitativa, é necessário e que façamos uma calibração com um padrão de concentrações de componentes próximas as da amostra que iremos analisar.A preparação de um padrão cromatográfico não é tarefa difícil de se realizar porém, é necessário que antes da preparação, conheçamos algumas propriedades dos componentes que farão parte deste bem como , para definir a sua composição ,a origem da amostra que será analisada. As purezas do padrão e do solvente deverão ser de alto grau.


PROCEDIMENTOS   

Para se preparar de um padrão cromatográfico necessitamos realizar os seguintes passos: 1)  selecionar os reagentes que farão parte do padrão com suas respectivas purezas conhecidas. 2)  selecionar os materiais e equipamentos que serão usados: seringa, balança analítica,papel absorvente,e o recipiente onde será preparado o padrão (frasco).Todo o material utilizado deverá estar limpo com detergentes ou com solução sulfocrômica , para que todo material orgânico seja eliminado e,após a lavagem,secar em estufa à 100oC POR 1 hora. 3)  Com base na possível concentração dos componentes da amostra e nas suas purezas, calcular as massas que deverão ser pesadas. O solvente utilizado para preparar os padrões, deverá ser o mesmo para a preparação das amostras e fase móvel para o sistema.Na tabela abaixo, você encontrará uma metodologia para a determinação de um antixidante comum o BHT usado no solvente tetrahidrofurano para análise de GPC, considerando uma adição de 0,02% em volume.Preparar em balão volumétrico de 100 ml os três padrões: 0,01%, 0,02% e 0,03%, adicionando respectivamente a cada balão as seguintes massas: 0,01g , 0,02g e 0,03g. Em seguida completar o volume com o tetrahidrofurano e agitar até a completa dissolução. CONDIÇÕES DE ANÁLISE  NO DETETOR DE ULTRAVIOLETA : comprimento de onda= 280 nm , volume de injeção de 200ul , vazão da fase móvel de 1ml /min tetrahidrofurano sem BHT. Os valores de absorbância são apenas ilustrativos.          

TABELA-1 : Concentração teórica dos componentes e massas a adicionar no padrão para cada 100 ml de tetrahidrofurano.

padrãoConcentração Teórica de BHT  Massa a pesar
1 0,0100% 0,0100g
2 0,0300% 0,0300g
 3 0,0500% 0,0500g

Padrão Concentração Teórica de BHT

Massa a pesar

1  0,0100%  0,0100g 2  0,0300%  0,0300g  3  0,0500%  0,0500g
TABELA-2 : Concentração real do BHT considerando uma pureza de 99% .

Padrão Pureza (valor da pureza em % / 100)

Concentração real 1  0.990   0,0099% 2  0.990   0,0297%  3  0,990  0,0495%

LEITURA DAS ABSORBÂNCIAS DOS PADRÕES

Após o ajuste do equipamento,para as condições acima citadas, injetar cada padrão três vezes  e depois tirar a média das absorbâncias.Traçar um gráfico lançando em ordenadas os valores correspondentes às absorbâncias e nas abscissas os valores das concentrações individuais dos padrões  de BHT.   TABELA-2 : Tabela  das absorbâncias correspondentes a cada padrão. Padrão em %BHT

Absorbância de cada padrão obtidas  em 280 nm 0   0   0,0099% 0,120   0,0297% 0,360  0,0495% 0,600

ANÁLISE QUANTITATIVA POR ADIÇÃO DE PADRÃO ·

  Determinação da concentração de uma substância através da adição de padrões:Consiste em elaborar padrões a partir da própria amostra ,seguindo as seguintes etapas:

1) obter o espectro da substância já conhecida,

2) medir a absorbância da banda do espectro, escolhida referente ao que se deseja quantificar,

3) preparar os padrões, adicionando-se quantidades conhecidas da substância pura,

4) fazer a leitura de cada padrão , e através dos espectros obtidos, medir a absorbância  de cada um . Anotar os valores.

5) traçar um gráfico de ABS em função da quantidade de substância adicionada,

6) extrapolar a curva obtida até a intersecção com o eixo X, encontrando-se o valor da substância na amostra.

CALIBRAÇÃO EM ÁREA PORCENTO

É o cálculo da concentração de todos componentes de uma amostra , relativo ao somatório da área total destes.Este método não é utilizado na cromatografia líquida.

CALIBRAÇÃO POR PADRONIZAÇÃO EXTERNA   

Para se trabalhar com cromatografia líquida é necessário que façamos uma calibração, com padrões de concentrações de componentes próximas as da amostra que iremos analisar.A preparação de um padrão cromatográfico não é tarefa difícil de se realizar porém, é necessário que antes da preparação, conheçamos algumas propriedades dos componentes que farão parte deste bem como , para definir a sua composição ,a origem da amostra que será analisada.A pureza do padrão deverá ser conhecida.Abaixo cito duas maneiras de quantificação por padronização externa.

1) CALIBRAÇÃO ATRAVÉS DO  MÉTODO DA ABSORTIVIDADE MOLAR


   A  forma mais simples , de se construir a curva de calibração, é calcular a absortividade molar da espécie química a cada concentração , e no final tira-se a média destes. A absortividade , neste caso é calculada dividindo-se cada valor individual de concentração pela sua respectiva absorbância seguindo a fórmula:  

Absortividade Molar = absorbância / concentração X d

Onde: d= volume da célula igual a 8ul

Padrão em %BHT

Absorbância de cada padrão obtidas  em 280 nm. Absortividade g/L 0   0 0   0,0099% 0,120 12,121   0,0297% 0,360 12,121  0,0495% 0,600 12,121 A média será igual a : Absortividade Molar (g/l) ou % =12,121

CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DO BHT NO SOLVENTE

 Abaixo encontramos o cálculo  para determinar a concentração de BHT de uma amostra desconhecida , a partir da  absortividade do BHT , utilizando uma célula de 8ul.Veja abaixo a fórmula de cálculo da concentração de BBHT. A concentração do BHT da amostra é com relação a uma leitura de absorbância igual a 0,148.

Concentração (g/l) ou %=absorbância / absortividadeConcentração (g/l) ou %=0,148 / 12,121 Concentração (g/l) ou %=0,122  

2) CONSTRUÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃOMÉTODO DA REGRESSÃO LINEAR COM O PROGRAMA EXCEL

Seqüência da construção:

1) digitar  em duas colunas paralelas os valores das concentrações e das respectivas absorbâncias dos padrões.Veja a tabela abaixo. 0,00000,00000,00990,12000,02970,36000,04950,6000

0,00000,0000
0,00990,1200
0,02970,3600
0,04950,6000

2) com a utilização do mouse, selecionar todos as  colunas da tabela elaborada. 0,00000,00000,00990,12000,02970,36000,04950,6000

0,00000,0000
0,00990,1200
0,02970,3600
0,04950,6000

3) clicar no ícone de construção de gráficos no EXCEL.

4) selecionar o tipo dispersão , o primeiro subtipo que compara pares de valores e clic  com o mouse em avançar duas vezes.

5) digitar em título do gráfico : CURVA DO BHT EM THF POR HPLC

6) digitar em eixo dos valores(x): CONCENTRAÇÃO DO BHT(%) digitar em eixo dos valores (y): ABSORBÂNCIAS DOS PADRÕES, e em seguida clic em avançar e em seguida clic com o mouse em concluir.

7) expandir a área do gráfico ,para uma melhor visualização, através do arraste do mouse.

8) com a ajuda do mouse, clic num dos pontos da curva no gráfico.Todos os pontos da curva ficarão amarelos.  

9) clic em gráfico na barra superior e na janela que abre, clic em adicionar linhas de tendência. Na tela que abre , selecionar a opção linear.

10) clic na tela adicionar linhas de tendência, em opções. Marque os campos: definir interseção =0 , exibir equação no gráfico e exibir valor de R-quadrado no gráfico. Clic em OK. Para um melhor destaque dos valores de Y e R2, marque a área destes e clic em cor do preenchimento (selecione a sua cor) na barra superior do EXCEL.

11) Calcular a concentração do BHT no THF,usando a seguinte fórmula: %BHT =  ABSORBÂNCIA /  12,121

CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DO BHT NO SOLVENTE

Abaixo encontramos o cálculo  para determinar a concentração de BHT de uma amostra desconhecida , a partir da  curva de regressão linear utilizando uma célula de 8ul.Veja abaixo a fórmula de cálculo da concentração de BBHT. A concentração do BHT da amostra é com relação a uma leitura de absorbância igual a 0,148. %BHT =  ABSORBÂNCIA /  12,121  %BHT= 0,148 / 12,121= 0,122%